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产品简介
购买须知
| 产品名称 | 乳酸菌电转化方法 |
| 商品货号 | TSPLA11098 |
| 商品信息 | 乳酸球菌电转化试剂配制： （1）电转缓冲液I：称取0.2 g六水氯化镁，205.4 g蔗糖，1.86g三水磷酸钾，用去离子水定容至1L,然后用浓盐酸调节pH至7.5。 （2）电转缓冲液II (g/L)：称取171.15g蔗糖，并量100mL甘油，加去离子水定容至1L。 （3）复苏液：称取20 g葡萄糖，2g柠檬酸氢二铵，171.15 g蔗糖，2 g磷酸氢二钾，10g胰蛋白胨，0.2g七水硫酸镁，4g酵母提取物，3g乙酸钠，0.05g-水硫酸锰，8 g牛肉膏，ImL的吐温80,加去离子水定容至1L。 （4）Tris-Cl缓冲液(pH8.0)：称取121 mg Tris溶于去离子水中，并用浓盐酸调节 pH至8.0,最后加水定容至100 mLo （5）溶菌酶母液(Img/mL)： 5mg溶菌酶干粉溶于5mLTris-Cl缓冲液(pH8.0) 中，用0.22 um滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。溶菌酶为碱性溶菌酶。 （6）D/L-苏氨酸溶液(1 mg/mL)：称取587mgD/L-苏氨酸溶于5 mL超纯水中，并 使用0.22um滤膜进行过滤除菌。 （7）红霉素母液(50mg/mL)：称取250mg红霉素粉末溶于5 mL无水乙醇中，完 全溶解后，使用0.22um滤膜进行过滤除菌，并于-20℃避光保存。 乳酸球菌电转化感受态制备：(所用缓冲液提前置于冰上冷却)。 （1）取冻存管中的乳酸球菌划线至MRS平板上，于42°C培养箱中静置培养 24 h,长出单菌落后挑取至20 mL液体MRS中42°C, 150 rpm培养12h。 （2）取400ul培养液转接至新鲜MRS培养液中(含终浓度40 mM的D/L-苏氨酸溶液)， 42°C, 150rpm培养约6h至OD600为1.0,冰上放置10min. （3）取1.5 mL菌液4 °C, 10000 rpm离心5 min,弃上清，加入1 mL电转缓冲液 I悬浮菌体后，4 °C, 10000 rpm离心5 min,弃上清，再加入1 mL电转缓冲液I重复离心一次，去上清。 （4）用100ul电转缓冲液I悬浮菌体，加入10ul的lmg/mL溶菌酶溶液，并于 37 °C水浴锅中处理至少30 min.。 （5）4°C, 10000 rpm离心5 min后，弃上清，再加入1 mL电转缓冲液I悬浮菌体后离心去上清(重复一次)，最后加入70ul电转缓冲液II悬浮细胞，得到电转感受态。 乳酸球菌电转条件 （１）取7ul质粒和加入70ul感受态细胞，轻轻混合后，冰上放置10min。 （２）将质粒与感受态的混合液转移至预冷的1mm电击杯中，在2000V，200Ω，25uF条件下进行电击（Gene Pulser Xcell BioRad），然后将电击后的液体立即转移至900ml预冷的复苏液中，冰上放置５min。 （３）42℃，150rpm 培养大约3h,视菌生长情况，6000rpm离心5min,取800ul上清，涂布于加红霉素MRS平板。红霉素的浓度为10ug/ml。 （4）42℃培养48h,挑取菌落验证。并提取质粒进行测序。保菌时甘油终浓度为10%。 |
| 使用说明 | 质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必先转化提质粒后使用）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒; ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作） ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min; ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子） ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h;(菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另外不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态); ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。 |
