微信小陈
微信小章试剂名称 | 内容 | 数量 |
Solution 1 | 标准品DNA模板（5x10^9 copies/μl） | 100μl |
Solution2 | Lenti-primer (10μM) | 40μl |
Solution 3 | Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM) | 80μl |
Solution 4 | Taq (probe qPCR) (2X) | 1ml |
Solution 5 | ROXI(50X) | 40μl |
Solution 6 | ROX II(50X) | 80μl |
操作流程：
1.取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;
2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；
3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：
| | 标准品管 | 样品管 | |||||
| # | 稀释倍数 | Water | 标准品 | 拷贝数/μl | 稀释倍数 | Water | 样品(50ng/μl) |
| 1 | 10^1 | 45μl | 5μl | 5.45x10^8 | 10 | 45μl | 5μl |
| 2 | 10^2 | 45μl | 5μl of 1# | 5.45x10^7 | 50 | 40μl | 10μl of #1 |
| 3 | 10^3 | 45μl | 5μl of 2# | 5.45x10^6 | 100 | 45 | 5μl of #1 |
| 4 | 10^4 | 45μl | 5μl of 3# | 5.45x10^5 | | ||
| 5 | 10^5 | 45μl | 5μl of 4# | 5.45x10^4 | |||
| 6 | 10^6 | 45μl | 5μl of 5# | 5.45x10^3 | |||
梯度稀释取样前，需充分混匀；
4.根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
| 标准品或样本 | 2μl | *1 |
| Lenti-primer (10μM) | 0.4μl | 0.2μM |
| Lenti-probe (2.5μM) | 0.8μl | 0.1μM |
| Taq (probe qPCR) (2X) | 10μl | 1X |
| ROX | *2 | |
| Water | 补至20μl | |
| | 适用仪器 |
| ROX I (终浓度1X) | 7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System |
| ROX II (终浓度0.5X) | 7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System |
| 无需ROX | Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System |
6.计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Loge(copy number)为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99；（具体过程可见举例）
7.计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。
8.计算病毒滴度：举例
Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；Nori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。
计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。（具体过程可见举例）
| 常见问题 | 建议 |
| 转染孵育后沉淀不可见或太细 | 加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。 |
| 转染孵育后沉淀物密度太大，有聚集的团块 | 加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。 |
| 无法从培养皿中洗去沉淀物 | 确保PBS不含Ca2+或Mg2+，洗液只含有配方中所列成分的阳离子。 |
| 转染效率高，但病毒滴度低 | 优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量，理论上表达质粒越大，包装所需用量越多。 |
6孔板 | 10cm培养皿 | 15cm 培养皿 | |
底面积 | cm2 | Cm2 | Cm2 |
底面积比 | 1 | 5.7 | 15.8 |
转染前换液体积 | 1.226 ml | 7 ml | 17.5 ml |
DNA-CaPO4 mixture体积 | 0.174 ml | 1 ml | 1.5 ml |
培养体积 | 2 ml | 10 ml | 25 ml |
洗涤体积 | 2 ml | 10 ml | 25 ml |