禽流感病毒 H5 亚型（AIV-H5）核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探针法)
商品名称：禽流感病毒 H5 亚型（AIV-H5）核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探针法)
Name ：Diagnostic Kit for Avian Influenza Virus subtype H5 RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包装规格】48 份/盒
本试剂盒适用于检测的禽喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织及棉拭子样品等标本中禽流感病毒 H5 亚型 RNA，适用于禽流感病毒 H5 亚型感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
本试剂盒用一对禽流感病毒 H5 亚型特异性引物，结合一条特异性荧光探针， 用一步法荧光 RT-PCR 技术对禽流感病毒 H5 亚型 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μl×1 管 |
AIV-H5 反应液 | 1.0ml×1 管 |
AIV-H5 阳性质控品 | 50μl ×1 管 |
阴性质控品 | 250μl ×1 管 |
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 5 次，
有效期 12 个月。
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2 等其他荧光定量 PCR 检测仪。
病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理盐水中。
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
推荐采用RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 | AIV-H5 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μl | 1μl |
将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μl，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿
选择 ROX 参比荧光。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycle | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35.0<Ct 值≤37，建议重复检测，如果检测通道仍为 35.0<Ct 值≤37，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果 Ct 值>37 或无 Ct 值。
Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。
最低检测限：5.0×102copies/ml。
精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。
Ø 所有操作严格按照说明书进行；
Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
Ø 反应液应避光保存；
Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
