【产品名称】
通用名称：肺炎支原体核酸实时荧光PCR检测试剂盒（TaqMan探针法）
英文名称： Real-Time PCR Diagnostic Kit for Rapid Detection of M.pneumoniae
【产品货号】 A3911-50T
【包装规格】 50反应/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于定性检测临床标本中的肺炎支原体核酸。实验结果仅为基础研究提供参考，不作为临床诊断依据。
【储存条件及有效期】
1. 运输：试剂盒必须在冷冻条件下运输。
2. 保存：-20℃保存，应避免反复冻融。
3. 有效期：12个月，请在有效期内使用。
【适用仪器】
经过通道校正的全自动荧光PCR检测仪，需含有FAM检测通道。
【检验原理】
本试剂盒采用实时荧光PCR技术，适用于从临床标本中提取的肺炎支原体的核酸检测。反应体系中含有检测肺炎支原体的特异性引物和探针，通过收集PCR扩增产生的荧光信号，即可快速完成对肺炎支原体核酸的定性检测。
【主要组成成分】
序号 | 组分名称 | 规格 |
1 | 无核酸酶水 | 1000μL×1管 |
2 | 2×核酸扩增反应液 | 500μL×1管 |
3 | 10×引物探针反应液（A3911） | 100μL×1管 |
4 | A3911-阳性对照 | 20μL×1管 |
注意：不同批次试剂盒成分不可混用！
【样本要求】
从临床标本中提取的DNA样品，均可使用本试剂盒进行检测。
【操作步骤】
1. 样品制备
按照本试剂盒配套的细菌DNA提取试剂进行核酸提取。提取的DNA可直接用于检测；若样本提取后不立即检测，也可存于-20℃或-70℃备用。应避免反复冻融。
2. 反应体系配制
（1）体系配制：从试剂盒中取出试剂室温融化，待试剂完全解冻，颠倒混匀后瞬时离心。若待检样品数量为n，则按n+1个反应配制体系（建议增加阳性对照和阴性对照体系），反应体系配制如下表。
试剂 | 1个反应体系的量 | n+1个反应体系的量 |
无核酸酶水 | 6μL | 6μL×（n+1） |
2×核酸扩增反应液 | 10μL | 10μL×（n+1） |
10×引物探针反应液（A3911） | 2μL | 2μL×（n+1） |
（2）体系分装：将上述反应液混匀离心后，按照每管18μL分装于荧光PCR仪适用的PCR管中。
（3）加样：分别取步骤1中提取的2μL DNA样品加入到分装好的PCR反应管中，总反应体积为20μL。阳性对照加入相应模板2μL。
3. 荧光PCR循环条件设置
程序 | 循环数 | 温度 | 反应时间 | |
1 | 1 | 95℃ | 5min | |
2 | 40 | 95℃ | 15sec | |
60℃ | 45sec | 采集荧光 | ||
检测设置：“Reporter Dye”设置为FAM，对应肺炎支原体核酸的检测，“Quencher Dye”为None。对于ABI系列仪器，注意将“Passive Reference”设置为None。
4. 结果分析与判定
（1）调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过正常阴性对照的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整。
（2）质量控制：空白对照和阴性对照无扩增曲线，且阳性对照在FAM通道有S型扩增曲线，实验成立。否则视实验结果无效。
（3）结果判断与解释：a）若样品有S型扩增，且Ct值≤35，则判定样品为肺炎支原体核酸阳性；b）若有S型扩增，且35＜Ct值≤40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；若复检的样品仍有S型扩增，且Ct值≤40，则判定样品为肺炎支原体核酸阳性，否则为阴性；c）若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct值，判定为肺炎支原体核酸阴性。
【检测方法的局限性】
本试剂盒检测的靶序列为肺炎支原体基因的保守区域，该靶基因高度保守。但如果细菌在靶序列处发生基因突变，则可能出现假阴性结果，即发生漏检；同时，样品收集、处理、运送和保存的质量均对检测结果造成影响。
【注意事项】
1. 实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按操作步骤执行。
2. 试剂盒内各组分在使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后使用。
3. 试剂盒须避光保存，以免荧光物质衰减。所使用的离心管、Tip头应高压灭菌，且不含DNase和RNase。
4. 整个操作过程和PCR实验室的软硬件设施应符合卫生部颁布《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》等法规的要求。并恰当处理实验过程中产生的废物和扩增产物，防止交叉污染。
