抗原和抗体 ELISA 中用到的抗原可以是纯化的天然抗原、重组抗原、人工合成多肽、 小分子化合物等，天然的抗原具有天然的构象，保持了天然的免疫原特性，但 是一般来说纯化难度都很大，而且天然的抗原丰度都较低，获取难度非常大， 重组抗原相对制备比较容易，但是实验中难以避免引入工程菌菌体自身的蛋 白，如果纯化不好容易对实验造成干扰。人工合成多肽特异性较好，但是所含的表位很少，仅能检测与其相对应的抗体的系统。另外由于多肽分子量小，而 且疏水性不是很强，所以包被难度较大，如果常规方法不能很好地包被则需要 考虑与载体蛋白相偶联然后再包被。 ELISA 中用到的抗体应该具有较强的亲和力和较高的特异性，而且一般 来讲纯度越高越好，推荐使用抗原亲和纯化（多抗）或使用 Protein A，G 纯化 （单抗），减少目标抗体对实验的干扰。也有少数情况下直接用小鼠腹水包被的。
关于包被液的讲解请参考“将抗原或抗体吸附到固相载体上”一部份， 这里只简要给出几种包被液的配方。
(1) 50mM pH 9.6 的碳酸盐缓冲液： Na2CO3 1.59g NaHCO3 2.63g 加蒸馏水至 1 L
(2) 20mM pH 8.5 的 Tris-HCl Tris 2.42g 加蒸馏水至 1 L，用 HCl 调 pH 至 8.5
(3) 10mM pH 7.2 PBS KH2PO4 0.2g Na2HPO4·12H2O 2.9g NaCl 8.0g 加蒸馏水至 1 L
封闭试剂一般都用 PBST 溶解，即在上述 10mM pH 7.2 PBS 的基础上 加入 0.2% Tween-20 即可。 抗原或抗体稀释液 抗原或抗体稀释液可以是 PBS、PBST、封闭液、生理盐水等，理论上讲 封闭液是最理想的抗原或抗体稀释液，但有时候为了节省试剂和操作，PBS 作为稀释液应用更广泛。
酶标抗原或抗体是 ELISA 中最重要的试剂，也是 ELISA（酶联免疫吸附 测定）名称的由来原因。目前在 ELISA 体系中可以引入的作为标记用的酶主 要有四种：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、ß-半乳糖苷酶（β -Galactosidase,BG）、脲酶（Urease）。下表将它们各自的底物以及显色反应结 果一一列出。
HRP 酶最初从植物辣根中提取，它一共至少有七种同工酶，目前商业化 的 HRP 酶至少有一半以上是同功酶 C，商业化的 HRP 酶活性一般都非常强， 其主要作用底物是过氧化氢（也可以作用于过氧化脲），但是高浓度的过氧化 氢对其活性有很强的抑制作用，因此在使用时过氧化氢的浓度非常关键。
（1） OPD（邻苯二胺）是早些年 ELISA 中最常用的底物，其工作浓度 一般为 0.4mg/ml，底物缓冲液用 0.1M pH 5.0 柠檬酸钠缓冲液。商业化的 OPD 有预先称好质量的片剂，使用前直接溶解在指定体积的缓冲液中即可，OPD 体系中 H2O2 的浓度一般为 0.004%
（2） TMB（3,3’,5,5’-四甲联苯胺）毒性低，而且颜色对比很明显，近 些年来非常受欢迎。其工作浓度从 0.0005%-0.01%范围内都可以使用，实验中 一般使用其盐酸盐，因为其盐酸盐的溶解性比其本身溶解性强。TMB 底物体系中过氧化氢的浓度也在 0.004%左右比较合适。其底物缓冲液一般使用 0.1M pH 5.0 柠檬酸钠缓冲液或 0.1 M pH 5.6 醋酸盐缓冲液。
（3） ABTS（2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）使用的工作浓度 也为 0.4mg/ml，系统中过氧化氢浓度在 0.002%左右适宜。底物缓冲液一般用 0.1 M pH 4.0 磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液。ABTS 也有商业化的片剂销售。
（4） 5-氨基水杨酸灵敏度较差，现在基本已不用。
（5） DAB（二氨基联苯胺）底物的终产物为棕色沉淀，不方便用酶标 仪进行判读结果，所以在 ELISA 中应用较少，但在 Western Blot 中应用较多， 其使用浓度一般在0.5mg/ml，过氧化氢使用浓度为0.02%，底物缓冲液用pH 7.4 PBS 或者 Tris-HCl。
碱性磷酸酶源于牛小肠或大肠杆菌，不同来源的碱性磷酸酶使用的缓冲液也不 一样。对于大肠杆菌来源的碱性磷酸酶，其缓冲液一般用 0.1M pH 8.1 Tirs， 含 0.01% MgCl2。对于小肠来源的碱性磷酸酶，其缓冲液一般用 pH 9.8 的 10% 二乙醇胺（含 0.5mM MgCl2）。其底物对硝基苯酚磷酸盐（PNPP）工作浓度 一般为 1mg/ml，反应结束后用 0.1 倍体积的2M 碳酸钠终止反应。
ß-半乳糖苷酶底物是 ONPG（邻硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷），其使用浓度 一般为 0.7mg/ml，底物缓冲液用 0.1 M pH7.0 磷酸氢二钾缓冲液，并包含 1mM MgCl2 和 0.01 M 2-巯基乙醇，反应结束后用 0.25 倍体积的 2M 碳酸钠终止反应。
脲酶底物尿素可被脲酶分解释放出氨，使 pH 升高，溴甲酚紫在弱酸性条 件(pH 4.8)条件下显黄色，随着反应的 pH 升高，其颜色变为紫色。反应完后 每孔用 10ul 硫柳汞终止。
