宁波泰斯拓生物

Rgp 酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定微生物样本中 Rgp 的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中 Rgp 水平。用纯化的 Rgp 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 Rgp，再与 HRP 标记的 Rgp 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 Rgp 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中 Rgp 浓度。

试剂盒组成：

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：80、40、20、10、5 ng/L

标本要求：

1.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 加样：标准品设定 5 个浓度点 10 个孔，每个浓度设定平行孔，加入 50 微升不同浓度的标准品，空白孔设定 1 个孔加入 50 微升蒸馏水（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl， 然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

3. 配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30（48T 的 20 倍）倍稀释后备用。

4. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

5. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

6. 温育：操作同 2。

7. 洗涤：操作同 4。

8. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.

9. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

10. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

注意事项：

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好  控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

（此图仅供参考）

试剂盒性能：

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.990 以上。

2. 批内与批间应分别小于 9%和 11%

检测范围：

2ng/L - 90ng/L

保存条件及有效期：

1. 试剂盒保存：2-8℃。

2. 有效期：12 个月