不管是哪一种 ELISA，它的操作都由以下几种基本的操作组合而成：
（1）将抗原或抗体吸附到固相载体上；
（2）封闭；
（3）加入待检样品以及后续试剂；
（4）温育；
（5）洗涤去掉游离未结合的反应物；
（6）加入酶检测底物；
（7） 结果的判读。这里针对每一个单独步骤进行讲解，请读者根据实验原理部分的讲解体会操作过程。
将抗原或抗体吸附到固相载体上
这一步又叫包被，是 ELISA 操作中非常关键的一步，包被的好坏直接影
响到 ELISA 的灵敏度和特异性。包被过程至少应该考虑以下影响因素：
固相载体的选择 固相载体有多种多样的形式，它可以是微孔板、小试管、
微珠或者膜，其中 96 孔板是应用最广泛的形式。固相载体的材料也有很多种，
常见的材料有聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、纤维素等，它们都能非
特异性吸附蛋白质，这种吸附是基于抗原疏水特性而发生的物理性吸附，并未
发生化学变化，所以抗原被吸附到固相载体上后仍然保持其免疫学活性。聚苯
乙烯因其价格低廉、对蛋白的吸附能力强，所以应用最广泛。需要注意的是，
所有酶标板因厂商生产工艺的差别，不同厂商或同一厂商不同批次之间的酶标
板对蛋白吸附能力都不同，所以每次更换新的酶标板前都应该设计预实验确定
酶标板的均一性是否良好。
包被的温度与时间 前面讲过，包被是根据抗原或抗体与固相载体间的
疏水作用而发生吸附的，一般来讲，温度越高，蛋白质的疏水作用就越明显，
因此对于蛋白质抗原或抗体来说适当提高温度有利于包被的进行，但是温度过
高会影响抗原或抗体的结构。一般包被都在 37℃进行 1-3小时，如果包被的温
度较低，则需要延长包被时间，例如 4℃包被一般都需要过夜。包被的时间不
能太短，否则包被不能充分进行。
包被缓冲液 包被缓冲液一个主要作用就是提高抗原或抗体的疏水性但
不至于破坏其免疫活性。理论上讲，对于蛋白质类抗原或抗体的最佳包被 pH
应该比其 PI 高 1-2 个单位，这是因为在 PI 以及更低的 pH 条件下，蛋白质总是倾向于将亲水基团暴露在外而将疏水基团包裹在内部，而偏碱性的条件有利
于其疏水基团的暴露，从而增强其与固相载体的结合。然而实际操作中，每种
蛋白质的 PI 都是很难确定的，所以包被缓冲液首选公认比较好用的缓冲液，
如 50mM pH 9.6 的碳酸盐缓冲液。另外也可以尝试 20mM Tris-HCl，pH 8.5，
还可以尝试 10mM PBS，pH 7.2。有时候提高缓冲液的离子浓度也可以提高抗
原或抗体的疏水性，此时可以尝试向缓冲液中加入 0.6M 左右的 NaCl。有些小
分子物质比较难以包被，可以采取特殊的方法包被，例如对于脂类分子的包被，
可先将其溶解于酒精中，然后加至酶标板孔，最后自然条件下放置使酒精挥发
充分从而最终只留下脂类分子。对于某些小分子多肽也可以采用类似的方法，
如采用低浓度的 Tirs-HCl 将多肽稀释好，加到酶标板孔内，自然放置晾干也可
以达到比较好的包被效果。
最佳包被量 最佳包被量是需要通过实验来确定的，最常用的办法是棋
盘滴定法，即做多个平行实验，采用不同浓度的抗原或抗体包被，另外再对系
统里其它的试剂也做不等浓度的平行实验，最终根据反应的灵敏度和信噪比确
定最佳包被量。对于初学 ELISA 的实验者或者不是很严格的实验来说，
一般按 1-10ug/ml，每孔 50-100ul 左右的蛋白类抗原或抗体包被比较合理，然后再在此基础上进行向上或向下调节。
封闭
抗原或抗体包被完成后，固相载体表面依然存在未被占用的位点，这些
位点还可以继续结合抗原或抗体，为了排除这些位点对 ELISA 后继步骤的干
扰，就需要引入一些无关的物质将这些位点占用，这个过程就是封闭。最常用
的办法就是使用惰性蛋白封闭，常见的惰性蛋白可以是 0.05-0.5% BSA、1%明
胶、5%脱脂奶粉、10%小牛血清，1-3% Casein，也可以采用去垢剂进行封闭，
如 Triton X-100， Tween-20 等。其中 5%脱脂奶粉价格最便宜，在一般实验室
常规实验中应用较多，但是由于奶粉的成份复杂，批次间差异非常 大，所以
一般很少应用于试剂盒中。试剂盒中应用较多的是成份相对简单的 BSA 和明
胶，需要注意的是有些厂商生产的 BSA 里含有较高浓度的牛抗体，在实验中
有可能与二抗进行结合从而造成假阳性的情况。
加入待检样品以及后续试剂
加样过程最关键的要点就是移液器的正确使用。在 ELISA 操作中几乎每 一步都需要用移液器，移液器应不定期校正、吸取液体后是否会因为漏气而液
体自动滴出、移液器内是否有脏物堵塞等。取液时，先将移液器调至正确量程，
再将移液器按至第一停点，将 Tip 头浸入液面以下 1cm 左右轻轻吸取液体，打
出液体时先打至第一停点，稍等片刻后再打至第二停点以全部排出液体，加样
至酶标板孔时应倾斜 45 度左右加样，Tip 头不可以伸入酶标板孔与孔壁或底部
接触。同一 Tip 头不可取用两种不同的试剂。
温育
抗原-抗体的反应一般都在 37℃进行，大多实验都在 1 小时左右为宜，也有采用 4℃反应过夜。37℃一般采用恒温摇床进行，切记摇床内酶标板不可堆叠以保证同一块板各孔受热均匀
洗涤去掉游离未结合的反应物
洗涤过程比较简单，直接用洗涤液洗涤掉孔内未结合的反应物，可以手
工洗板，也可以用洗板机进行。 常见的洗涤液是 PBS 或 PBST（即添加 0.2%
的 Tween-20 的 PBS），一般的洗涤程序都是每次 5min，洗涤三次，也可以根据实际需要增加洗涤次数和延长洗涤时间。每次洗涤完后，用力甩掉板孔内液
体，再在毛巾上用力拍干。
加入酶检测底物
ELISA 的底物一般都先配成母液，用前临时配成工作液使用，配制工作液时注意防止污染，如金属离子的污染、酶标抗原或抗体的污染等。加底物时
注意不要溅出至临近的孔内。
结果的判读
ELISA 的结果可以根据需要采用肉眼判读或用酶标仪判读。肉眼判读只
适用于定性 ELISA，如果需要定量则必须使用酶标仪，并且一般都需要用终止 液终止反应才能判读。使用酶标仪时也应该注意结合肉眼观察的结果大致判断仪器读出的结果是否异常。读完结果后，需要定性的根据判定依据给出“阳性” 或“阴性”结论，需要定量的，先作出标准曲线，再通过标准曲线确定检测的 样品中抗原或抗体浓度。
