泰斯拓生物：重组蛋白纯化概述
蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分，尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中，上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离，充分利用上游对下游的影响，对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。是否带有亲和标签，His标签，GST标签等，不同的亲和标签选择不同的纯化方案；可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低；是否对宿主细胞具有毒性，从而选择抗毒性的表达系统；怎样选择表达系统，是大肠杆菌表达系统，酵母表达系统还是CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统；蛋白的化学性质，是否容易被蛋白酶降解，是否会和一些金属离子，化学成分发生反应；蛋白的物理性质，是否对温度敏感等。从蛋白基因的获取，蛋白基因的克隆，蛋白的表达，做好一个整体的规划，将对纯化工作的方便快捷高效带来关键的影响。
基因工程构建的纯化标记有很多，通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。GST融合载体，蛋白A融合载体，含组氨酸标记（Histidine-tagged）等，不同亲和标签的蛋白有不同的纯化方案。
一．含组氨酸标记（Histidine-tagged）重组蛋白的纯化
（一）选择亲和标签时需要考虑的因素
亲和标签与目标蛋白之间的作用是相互的，需要综合的考虑，既要考虑到对目标蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。（1）亲和标签是否会影响到目标蛋白的结构和功能，大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的肽标签对目标蛋白的结构影响最小，而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。（2）亲和标签对蛋白质稳定性的影响，亲和标签的加入是否会影响到目标蛋白的真确折叠，是促进目标蛋白的可溶性，还是容易形成包涵体，会不会造成氨基酸C和N段地破坏，使目的蛋白表达不完全。（3）亲和标签所融合的位置，亲和标签可以加在N端，可以加在C端，也进行串联。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。可能有些蛋白纯化后需要去除亲和标签C端融合在去除融合标签后在目标蛋白的C端会有几个氨基酸残留，而小心的选择剪切特异性的氨基酸序列就可以在去除N端亲和标签后得到天然的目标蛋白。（4）亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目标蛋白变性。
（二）含组氨酸蛋白纯化的依据
蛋白质表面的组氨酸与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+形成配位相互作用，从而能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，固定有这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地纯化这类含有多个组氨酸的蛋白以及多肽和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸与固定金属离子结合力要远小于组氨酸残基，对纯化影响不大。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
蛋白样品的预处理
1．诱导方式:诱导方式的选择上，为了得到真确折叠的目的蛋白，表达菌种的生长情况，菌种是否健壮，是否是单克隆菌种，菌体的浓度是否适合诱导，生长状态不好的表达菌，一方面会造成目的蛋白的错误折叠，造成蛋白大小，形态等发生改变，另一方面会因为IPTG的加入，导致菌体的死亡或者降解。
低温度诱导有助于蛋白二硫键的正确折叠，但对于高温表达的蛋白不适合低温状态，温度过高容易导致包涵体的形成。
诱导剂：基因的诱导表达基于乳糖操纵子调节机制，没有乳糖存在的时候，阻碍物基因产生阻碍蛋白，阻碍蛋白和操纵子结合，抑制基因的表达；当有乳糖存在的时候，B-半乳糖苷酶和乳糖作用产生异半乳糖，异半乳糖和阻碍蛋白结合，解除抑制，激活基因，开始表达蛋白。诱导的浓度的高低对目的蛋白的表达也会有产生影响。BL21（DE3）, Rosetta(DE3)等大肠杆菌表达系统这些菌株都敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA开始转录。
3.抽提方式：进行破壁之前应该选择合适的缓冲组分， 合适的pH 要结合酸碱溶液的滴定调节，尽量低的离子强度 ，加入一些稳定成分稳定成分，EDTA螯合重金属离子，Triton X-100，NP40等表面活性剂，保护非极性表面等。
4.确定蛋白质样品的形态，浓度 黏度 体积。有时候得到粗蛋白的时候，会观是否符合目的蛋白的一些性质，确保得到是目标蛋白。粗蛋白的形态有没有明显的差异，浓度是否符合纯化的要求，是否有较多的干扰物质，核酸 色素 强结合成分。
5.优化表达条件
（1）重组蛋白不表达或者表达量低。如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有）通过改变诱导剂浓度，诱导温度，时间等都不表达的时候，然后尝试更换菌株、质粒载体。
降低诱导后培养温度。重组蛋白表达得越慢，其折叠效果就越好，大肠杆菌在4℃时依然可以表达重组蛋白，而将培养温度降低至25-30℃就能显著改善蛋白折叠。此方法不适用于温度诱导的重组蛋白表达；
减少诱导剂。诱导剂浓度可以降低至1/10；选用Lac渗透酶缺陷型菌株，如Tuner、Rosetta等，也有很好的效果。这类菌株能够使进入每个细胞的诱导剂浓度相同。重组蛋白在所有细胞中的表达水平相当时，减少诱导剂的效果更好。
（2）检查密码子构成，使其适应宿主菌的密码子偏好。稀有密码子，尤其是位于重组蛋白N端的和大量集中的稀有密码子，会降低mRNA稳定性，显著降低翻译速度，引起翻译提前中止、翻译移码和突变。将这些稀有密码子（尤其是N端！）突变为宿主偏好的密码子，能够显著提高表达水平。
改善蛋白稳定性。能够引起蛋白降解的因素很多，从蛋白自身性质到宿主性质不一而足，如果重组蛋白在表达时就被降解，表达量和稳定性就会受到很大影响。在大肠杆菌中表达重组蛋白，需要牢记N端法则：当N端第二个残基是Leu、Arg、Lys、Phe、Tyr和Trp时，重组蛋白半衰期只有2分钟，而小侧链的氨基酸残基，如Ala，则可以提高蛋白稳定性。因此在设计载体时，要特别注意第二个密码子，避免上述残基的出现。
处理高毒性蛋白：毒性极高的重组蛋白，其本底表达就会杀死原核宿主，质粒容易丢失，使其在大肠杆菌中很难得到高表达。采用可表达T7溶菌酶的宿主。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的抑制剂，采用含有T7溶菌酶质粒的宿主，如pLysS，可以降低重组蛋白在大肠杆菌快速生长期的本底表达量，在受到IPTG诱导时也能较好的表达蛋白。
（3）包涵体表达：包涵体蛋白折叠混乱、二硫键配对混乱、没有生物活性、变复性条件需要长时间摸索等，即使包涵体蛋白成功复性，其均一性和活性依然备受质疑。但是包涵体表达也有其优势：能够很轻松的获得超高的表达量，不可溶的重组蛋白不会被宿主内的蛋白酶降解，重组蛋白的毒性被大大抑制，杂蛋白含量低（~10%），容易纯化等。由于这些优点以及蛋白质复性条件的不断发展，表达包涵体蛋白逐渐为人们所接受，成为重组蛋白表达的一个常用方案。与可溶蛋白相反，提高培养温度、延长培养时间、在较高的菌密度下诱导都有利于包涵体的形成；在破菌和变性溶解时加入还原剂能够打开错配的二硫键；在复性液中加入二硫键异构酶、脯氨酸异构酶、分子伴侣和蛋白的辅助因子可以帮助重组蛋白折叠；精氨酸和高分子量PEG能减轻蛋白分子的聚集；尝试多种物理手段，如透析、快速稀释和柱上复性等，有时对复性有奇效。包涵体的表达相对简单，但其复性过程仍是依赖经验的，没有通用的方法可以套用。
（三）层析条件的选择
1.离子交换剂的选择
已知等电点的物质, 在高于其等电点的pH用阴离子交换剂, 在低于其等电点的pH用阳离子交换剂。同时要考虑到该物质的稳定性及溶解度, 选择适当的
pH 范围。
图1 蛋白质净电荷与pH的关系
参照电泳的结果。在中性或偏碱性条件下进行电泳, 向阳极移动较快的物质, 在同样条件下可被阴离子交换剂吸附, 向阴极移动或向阳极移动较慢的可被阳离子交换剂吸附。
2.缓冲液的选择
（1）选用的pH 决定于被分离物质的等电点, 以及稳定性和溶解度。选用的缓冲液离子, 其pK 值要接近于所要用的pH 值, 这样有较高的级冲能力, 可避免因缓冲离于与吸附剂相互作用而产生pH 改变。
（2）缓冲液离子应不影响被分离物的活性或干扰其测定。应不影响被测物的溶解度, 或会加入一些必要的保护剂稳定目的蛋白，防止变性或者沉淀。
（3）对于阳离子交换剂应使用阴离子型级冲液(如磷酸、醋酸等); 用阴离子交换剂时应使用阳离子型级冲液(如Tr is 、胺盐、吡啶等), 以避免缓冲液离子被吸附而发生pH 改变。
（四）操作步骤
1.离子交换剂的处理
（1）不同的离子交换剂需要不同的处理，亲和层析填料，需要一整套的化学工艺，使其结合上一些亲和配基，例如用于纯化带His标签的Ni2+-sephrose 4B 就是将琼脂搪用环氧抓丙烷交联并加以适当处理而制成的，具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。
（2）阴离子交换剂和阳离子交换剂的处理：采用碱一酸一碱的顺序洗。将干纤维素粉洒在0.5M NaOH 溶液中(每克千纤维素粉约15 毫升碱液)使自然沉降, 浸泡约30分钟, 用耐酸漏斗抽滤。如碱液呈黄色, 可重复洗至无色。用水充分洗净(用pH试纸试呈中性)。再用0.5 M HCl 洗, 再水洗, 再用N aOH 洗, 最后充分用水洗。碱洗时难过薄, 可加NaCl至0.5M。如仍难过滤, 可用10 倍水稀释, 使其沉降, 倾去上清液。
(3) 调节到所需p H 用上述条件的起始缓冲液充分洗涤使达到所要的p H 和盐浓度。
2.装柱
根据蛋白表达量的多少，装入适当的填料，用起始缓冲液充分平衡，用时候为了纯粹的收集蛋白，装柱没有太多的要求，当然应根据不同的实验目的采用的方法不一样，相对于需要蛋白紫外吸收图谱的，需要分辨率较好的或者是过分子筛的，装柱应该注意，装柱时的注意事项如下:
(l)交换剂悬浮液的浓度要适当, 细拉子可以浓一些, 加抽滤滤饼体积一半的缓冲液即可。粗拉子要稀一些, 太粗的粒子一克干重悬浮于50 一10 0 毫升中，装柱时不时摇动梨形瓶使悬浮液均匀。
(3 )注意沉积表面要平, 不平应重装。
(4 )柱中不要混入气泡, 可放在抽渝瓶中减压除气泡。如层析在低温进行, 则可于室温装柱, 然后用贮藏在室温的缓冲液拿到低温室去淋洗柱, 气泡即溶解在缓冲液中。
(5) 装柱后必须用起始缓冲液充分淋洗, 使床体积稳定并充分平衡使与起始缓冲液有相同的pH及电导度为止。
3.加样
（1）加样量的多少随实验目的不同和样品中目的物的浓度及其亲合力不同而有以下几种情况:当目的物在混合物中的含最极低, 而且是其中被吸附最紧密的, 为了浓缩富集, 可以将几倍于柱床体积的样品通过柱, 直到该成分饱和为止。然后洗脱得到富集物。当要求高分辨率时, 加样时紧密吸附的区带不超过床体积的10 %。
（2）核酸的吸附容量仅为蛋白质的1/100 , 可能是由于空间障碍。所以每克干交换剂只能加样1 毫克。小分子量物质亲合力低, 多不能形成紧密的区带, 加样量要少, 体积要小。
(3) 加样方法打开柱流出口, 排除床表面缓冲液,关闭出口, 用移液管加样, 其先端接触内壁在离床表面数毫米处, 随加随沿柱内壁转动一周, 然后速移至中心, 使样品尽快均匀分布于全表面。再打开出口, 继续加样, 待样品进入床内, 以少量缓冲液冲洗内欲数次, 加满缓冲液。
4. 洗脱
洗脱就是改变缓冲液的pH 或离子强度, 降低物质的亲合力, 使原来紧密吸附的物质逐步进入有限吸附平衡或解吸状态而由柱上洗脱下来。洗脱的办法有两种:
（1）增加缓冲液的离子强度, 使离子的竞争力加大。
（2）改变pH , 使被分离物质的解离度降低, 电荷减少。用阴离子交换剂时降低pH , 用阳离子交换剂时升高pH。
5. 洗脱成分纯度的鉴定
根据目的蛋白分子量的大小采用聚丙烯酞胺凝胶盘状电泳进行洗脱成分纯度的鉴定，根据电泳条带的情况，选择不同的方法对蛋白进行处理。
6.脱盐
可用透析、凝胶过滤或稀释法处理。透析用1/4的透析袋对20 倍体积的起始缓冲液透析过夜, 换一次缓冲液再透析6 小时, 透析时内外液均应不时搅动。凝胶过油可用交联葡聚塘* G 一25 或G -5 0 , 先用起始缓冲液平衡, 然后加样(不超过床体积的2 0% ), 再用起始缓冲液洗脱。蛋白质在一个空体积(v0 , 约相当l / 3 总体积)流出, 盐在一个总体积流出,分别收集之.可用牛血清蛋白做实验得到相应收集蛋白的体积。
7. 浓缩
1.离子交换柱浓缩法 将稀溶液大量地通过离子交换纤维素(或离子交换交联葡聚塘)柱, 直到饱和, 然后用较强的洗脱液一次洗脱。一般可浓缩100倍。
2.超滤 用适当的超滤膜(截留分子最在10，000以上) 及超滤装置可将蛋白质留在膜上, 水分及盐滤出。是一种方便有效的浓缩方法。
3.吸水剂处理 用干的交联葡聚塘凝胶G一25 或G一50 直接放入溶液中, 待吸足水分后过滤或离心除去凝胶。
