选择好一份已知为阳性和阴性背景的标本，将你的抗原用1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4进行倍比稀释（8个条件）后加入96孔板每孔100ul。（一般包被浓度100ng抗原或抗体/孔，最优包被条件需进行试验选择）4度过夜取出后甩干，加入20%NBS封闭每孔200ul。37度2h热封，甩去后拍干即可。将你HRP或AP标记的抗原或二抗用酶标稀释液进行稀释（倍比稀释4个梯度）即可。棋盘滴定就是板酶交叉,同时带上阳性、阴性通过试验确定最佳P/N的包被搭配E的试验
2．抗原和抗体最佳工作浓度的确定
抗原抗体反应要求在最适比例条件下进行，ELISA反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件。
1）方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度
用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后，按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照)，保温，洗涤。加工作浓度酶标抗体，洗涤，加底物显色，加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值；为0．8左右，阴性参考血清A值<0．1的包被抗原稀释度为工作浓度。
方阵(棋盘)法选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 将抗体用包被液稀释为10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三个浓度按行包被，每一个浓度包被三行(每行3孔)，分别在每个浓度包被的第一、二、三行中分别加入强阳性抗原，弱阳性抗原和阴性对照，将酶标抗抗体用稀释液稀释为1:l 000、l:5000、l:10000三个浓度，分别加入每个浓度包被的第一、二、三列中。加底物显色，加酸终止反应，分别读取A值。以强阳性抗原液A值在0.8左右，阴性参考A值<0.1的条件为最适条件。据此选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。
