一、产品信息（Product information）
产品编号：Human PD-1 ELISA Kit
规格：96T
检测范围：78.125-5000pg/ml。
敏感度：20pg/ml
保存：4℃可稳定保存6个月。
有效期：6个月（4℃）；12个月（-20℃）。
用途：用于体外定量分析人组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、血清、血浆、和其他体液中sPD-1的浓度。
二、产品描述（Description）
人PD-1DNA具有四个可变剪切本，其中PD-1Δex3仅缺失外显子3，编码的蛋白缺失跨膜区，表达可溶性PD-1（sPD-1）。PBMCs活化后PD-1膜型和可溶性PD-1剪切本表达增高。在自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎病人血清中发现高水平的sPD-1，其表达水平与临床免疫检测指标密切相关，由此提示sPD-1参与类风湿性关节炎的炎症病理过程。本单位研制了特异性检测人sPD-1ELISA试剂具有重要的临床相关疾病分析和检测价值。本试剂盒为预包被板，用于科研，而非诊断。
三、试剂盒组成（Materials Provided）
试剂 | 规格 | 数量 | 存储条件 |
Precoated ELISA plate | 8×12 | 1块 | 2-8℃ |
Standard | 10ng/管 | 2管 | 2-8℃ |
antibody-HRP | 10μl/管 | 1管 | -20℃ |
Dilution buffer（抗体稀释液） | 0.3g /瓶 | 2瓶 | 2-8℃ |
Washing buffer(20×) | 30ml/瓶 | 2瓶 | 2-8℃ |
TMB | 11ml/瓶 | 1瓶 | 2-8℃ |
Stop solution | 6ml/瓶 | 1瓶 | 2-8℃ |
封板膜 | 2张 | 室温 | |
说明书 | 1份 | 室温 |
注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致
四、需要实验者自行准备的试剂与仪器（Materials to be Provided by the End-User）
1．酶标仪（波长450nm，建议参考仪器使用说明提前预热）。
2．系列可调节移液器及及吸头，一次性检测样品较多时，最好用多通道移液器。
3. 蒸馏水或去离子水。
4. 干净的试管和 Eppendorf 管。
5. 全新滤纸。
6. 漩涡振荡器和磁力搅拌器。
7. 自动洗板机。
8. 37度恒温箱。
五、样品的准备和保存（Specimen Collection and Handling）
1.细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
2.细胞裂解液：对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用 PBS或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散。充分裂解后，10000-14000g 离心3-5min，取上清。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
3.血清：收集血液，室温凝固至少30 min， 1000×g离心10 min，收集血清。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
4.血浆：采用肝素抗凝管抽血后 30 min内离心 1000×g 10 min。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
5.其他体液：脑脊液、关节腔滑膜积液、尿液、精液等按上述要求，用无菌管收集，根据样本不同特性（酶解等）去除杂质，1000×g离心10-20 min，获得澄清液体。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
六、试剂和样品的准备（Reagent and Sample Preparation）
1. 人PD-1标准品的稀释和使用：在使用前2h内准备。试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
（1） 配制 10000pg/ml 标准品：取1000μl Dilution buffer加入标准品管内，盖好后静置 10 min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
（2） 配制 5000pg/ml→78.125pg/ml 标准品：准备8只 Eppendorf 管，每管加 500μl Dilution buffer，分别标记上 5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml，78.125pg/ml，0pg/ml，取500ul 10000pg/ml 的标准品加入标记 5000pg/ml 的管中，混匀后同样取出500μl 加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管（如下图所示）。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在 12 h内使用。
2. Antibody-HRP 抗体工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:4000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀。在使用前 2 h内准备。
3. Washing buffer工作液的准备：根据实际使用量计算总量，1:20用蒸馏水稀释。
4. Dilution buffer工作液的准备：每瓶用30ml 1×PBS稀释。
5. TMB显色液的准备：根据每孔需要100μl 计算总的用量。
6. 研究者须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围。一般来说，血清和血浆需1:1-10稀释，未知样本需进行梯度稀释以确定最佳稀释倍数。T细胞活化后培养上清建议原液检测。
七、操作过程（Assay Procedure）
1. 使用前，将所有的试剂充分混匀，避免产生气泡。
2. 根据实验孔（标准品、样品和空白孔）数量，确定所需的板条数目。
3. 从5000pg/ml管开始，每孔中加入100μl标准品或者样品，空白孔只加Dilution buffer，37℃孵育2h。
4. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸上拍干。
5. 加检测抗体：加入稀释好的antibody-HRP 100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
6. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 洗板8遍，弃去孔内液体，在滤纸上拍干。
7. 显色：加入TMB，100μl/孔，室温避光孵育15min左右，注意及时观察，如反应颜色过深需提前终止。
8. 终止反应：加入Stop solution 50μl/孔。
9. 读板：终止后10min内，用检测波长450nm读值。
八、结果分析（Typical Data）
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种软件来计算。若样品的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。每次检测均需要做标准曲线。
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘制标准曲线来计算标品含量
九、注意事项（Notice）
1. 试剂应按管上的标签说明书储存。
2．预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验室中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，4度可保存1个月。其余不用试剂应包装好或盖好。
3. Washing buffer（20×）在4度保存可能有结晶析出，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）在配置成Washing buffer（1×）工作液。
4. 检测抗体体积很小，使用前请高速短暂离心管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
5. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉感染。
6. 使用前检查试剂盒内各种试剂：试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每15min手工摇匀一次。
7. 实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
8. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。
9. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
10. TMB对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。有毒，避免用手接触！准备使用的TMB若变为蓝色，表明TMB已经污染，请丢弃。请在终止反应后10min内读取OD值。
11. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用恒温箱或培养箱孵育为好。
12. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。
13. 大于5000pg/ml的sPD-1样本应以Dilution buffer 稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
14. 特异性：不与同一家族里面的其他抗体反应。
十、参考文献 (References)
1．Monaghan SF, Chung CS, Chen Y, Lomas-Neira J, Fairbrother WG, Heffernan DS, Cioffi WG, Ayala A. Soluble programmed cell death receptor-1 (sPD-1): a potential biomarker with anti-inflammatory properties in human and experimental acute respiratory distress syndrome (ARDS). J Transl Med. 2016;14(1):312.
2. Liu C, Jiang J, Gao L, Wang X, Hu X, Wu M, Wu J, Xu T,Shi Q, Zhang X. Soluble PD-1 aggravates progression of collagen-induced arthritis through Th1 and Th17 pathway. Arthritis Res Ther. 2015;17:340.
3. Wan B, Nie H, Liu A, Feng G, He D, Xu R, Zhang Q, Dong C, Zhang JZ. Aberrant regulation of synovial T cell activation by soluble costimulatory molecules in rheumatoid arthritis. J Immunol. 2006;177(12):8844-50.
