一、产品信息（Product information）
规格：96T
检测范围：62.5-4000pg/ml。
敏感度：15pg/ml
重复性：板内、板间变异系数均＜5%
保存：4℃可稳定保存6个月。
有效期：6个月（4℃）；12个月（-20℃）。
用途：用于体外定量分析人组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、血清、血浆、和其他体液中可溶性CD40L的浓度。
二、产品描述（Description）
可溶性CD40配体(sCD40L)主要来源于活化的血小板及T淋巴细胞。sCD40L和CD40L一样都可以和CD40相互作用，通过提高黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs)、和组织因子的产生，导致一系列免疫应答和炎症反应。sCD40L可诱导血管内皮细胞和单核细胞产生血管内皮生长因子(VEGF)，促进血管生成。利用本单位研制的特异性sCD40L ELISA检测试剂分析发现，健康人组血清sCD40L水平明显高于再生障碍性贫血组和原发性血小板减少症紫癜组，类风湿性关节炎血清中sCD40L水平明显高于健康人组。因此检测血小板相关疾病和自身免疫性疾病患者血清中sCD40L含量的变化具有重要的临床价值。本试剂盒为预包被板，用于科研，而非诊断。
三、试剂盒组成（Materials Provided）
试剂 | 规格 | 数量 | 存储条件 |
Precoated ELISA plate | 8×12 | 1块 | 2-8℃ |
Standard | 4ng/管 | 2管 | 2-8℃ |
Antibody-HRP | 10μl/管 | 1管 | -20℃ |
Dilution buffer（抗体稀释液） | 0.3g /瓶 | 2瓶 | 2-8℃ |
Washing buffer(20×) | 30ml/瓶 | 2瓶 | 2-8℃ |
TMB | 11ml/瓶 | 1瓶 | 2-8℃ |
Stop solution | 6ml/瓶 | 1瓶 | 2-8℃ |
封板膜 | 2张 | 室温 | |
说明书 | 1份 | 室温 |
注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致
四、需要实验者自行准备的试剂与仪器（Materials to be Provided by the End-User）
1．酶标仪（波长450nm，建议参考仪器使用说明提前预热）。
2．系列可调节移液器及及吸头，一次性检测样品较多时，最好用多通道移液器。
3. 蒸馏水或去离子水。
4. 干净的试管和 Eppendorf 管。
5. 全新滤纸。
6. 漩涡振荡器和磁力搅拌器。
7. 自动洗板机。
8. 37度恒温箱。
五、样品的准备和保存（Specimen Collection and Handling）
1.细胞培养上清：离心去除沉淀，立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
2.细胞裂解液：对于贴壁细胞，去除培养液，用 PBS或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用 PBS或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散。充分裂解后，10000-14000g 离心3-5min，取上清。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
3.血清：收集血液，室温凝固至少30 min， 1000×g离心10 min，收集血清。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
4.血浆：采用肝素抗凝管抽血后 30 min内离心 1000×g 10 min。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
5.其他体液：脑脊液、关节腔滑膜积液、尿液、精液等按上述要求，用无菌管收集，根据样本不同特性（酶解等）去除杂质，1000×g离心10-20 min，获得澄清液体。立即分析或分装后-70℃冷冻保存。避免反复冻融。
六、试剂和样品的准备（Reagent and Sample Preparation）
1. 人CD40L标准品的稀释和使用：在使用前2h内准备。试剂盒提供2管标准品，每管4ng，每次使用1管。
（1） 配制 4000pg/ml 标准品：取1000μl Dilution buffer加入标准品管内，盖好后静置 10 min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
（2） 配制 2000pg/ml→62.5pg/ml 标准品：准备 7只 Eppendorf 管，每管加 500μl Dilution buffer，分别标记上 2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，0pg/ml，取500μl 4000pg/ml 的标准品加入标记 2000pg/ml 的管中，混匀后同样取出500μl 加入下一只管中。余同此类推，最后一只样品管不加（如下图所示）
注意：已经稀释的标准品（4,000pg/ml），应在 12 h内使用。
2. Antibody-HRP 抗体工作液的准备：根据每孔需要 100μl 计算总的用量。1:4000用Dilution buffer 稀释，轻轻混匀。在使用前 2 h内准备。
3. Washing buffer工作液的准备：根据实际使用量计算总量，1:20用蒸馏水稀释。
4. Dilution buffer工作液的准备：每瓶用30ml 1×PBS稀释。
5. TMB显色液的准备：根据每孔需要100μl 计算总的用量。
6. 研究者须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA 试剂盒的最佳检测范围。本试剂盒血清和血浆样本建议稀释比例为1:10-50，T细胞活化后培养上清建议原液检测，未知样本需进行梯度稀释以确定最佳稀释倍数。
七、操作过程（Assay Procedure）
1. 使用前，将所有的试剂充分混匀，避免产生气泡。
2. 根据实验孔（标准品、样品和空白孔）数量，确定所需的板条数目。
3. 从4000pg/ml号管开始，每孔中加入100μl标准品或者样品，空白孔只加入Dilution buffer，37℃孵育2h。
4. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 洗板3遍，弃去孔内液体，在滤纸上拍干。
5. 加检测抗体：加入稀释好的antibody-HRP 100μl/孔，盖上封板膜，37℃孵育1h。
6. 洗板：甩去孔内液体，Washing buffer 洗板6遍，弃去孔内液体，在滤纸上拍干。
7. 显色：加入稀释好的TMB，100μl/孔，室温避光孵育15min左右，注意及时观察，如反应颜色过深需提前终止。
8. 终止反应：加入Stop solution 50μl/孔。
9. 读板：终止后10min内，用检测波长450nm读值。
八、结果分析（Typical Data）
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种软件来计算。若样品的OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。每次检测均需要做标准曲线。
意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘制标准曲线来计算标品含量
九、注意事项（Notice）
1. 试剂应按管上的标签说明书储存。
2．预包被板条使用前，请恢复到室温后再打开外包装袋，实验室中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，4℃可保存1个月。其余不用试剂应包装好或盖好。
3. Washing buffer（20×）在4度保存可能有结晶析出，使用前务必使结晶完全溶解后（如加热、平衡温度后混匀等）在配置成Washing buffer（1×）工作液。
4. 检测抗体体积很小，使用前请高速短暂离心管子，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
5. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉感染。
6. 使用前检查试剂盒内各种试剂：试剂稀释、加样和中止反应充分混匀或者摇匀对实验结果尤为重要，最好使用低速频率振荡器或者反应过程中每15min手工摇匀一次。
7. 实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。
8. 使用洁净的塑料容器盛装洗涤液。
9. 洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，滤纸上看不到水印。勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。
10. TMB对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免金属接触影响结果。有毒，避免用手接触！准备使用的TMB若变为蓝色，表明TMB已经污染，请丢弃。请在终止反应后10min内读取OD值。
11. 请严格按照说明书标明的时间和温度进行孵育。冬季室内温度偏低，请使用恒温箱或培养箱孵育为好。
12. 试剂盒在保质期内使用，且不同批号试剂不要混用。
13. 大于4000pg/ml的sCD40L样本应以Dilution buffer 稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
14. 特异性：不与同一家族里面的其他抗体反应。
十、参考文献 (References)
1. Fan Y, Ge Y, Zhu H, Wang Y, Yang B, Zhuang Y, Ma H, Zhang X. Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against CD40L: epitope and functional studies on cell membrane CD40L and studies on the origin of soluble serumCD40L. Tissue Antigens. 2004; 64(3):257-263.
2. Napoleão P, Carmo MM, Pinheiro T. Prognostic evaluation of soluble CD40L in acute myocardial infarction: is not fancy, is science! Ann Transl Med. 2017;5(4):90
3. Bustamante AE, Jaime-Pérez JC, Cordero-Pérez P, Galindo-Rodríguez G, Muñoz-Espinosa LE, Villarreal-Villarreal CD, Mercado-Longoria R.A High Level of Soluble CD40L Is Associated with P. aeruginosa Infection in Patients with Cystic Fibrosis. PLoS One. 2016;11(12):e0168819
