基本原理
对生物合成过程进行标记，主要是为了研究蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程。通常将细胞放在含有充足营养成分和放射性标记氨基酸的培养基中，虽然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白质中的含量较低，但其35S标记物具有特异性高(>2.93 ×1013 Bq/mmol) 、容易检测的特点，因此是进行生物合成标记的首选氨基酸。下列步骤是对悬浮液中细胞（脾或胸腺的单细胞悬浮液或者培养物）进行短期标记的方法。
注意事项：
实验室应具备进行放射性化合物操作的各种相关设备。
1. 放射性工作专用的水浴槽，保温箱和离心机；
2. 在进行标记操作的时候，用盖革氏计数器监测操作区域；
3. 做好35S固体与液体废物的处理工作；
4. 在实验开始之前，要得到相关部门的批准；操作中，要严格地遵照国家管理条例的要求。
试剂与设备
l 在培养基中的细胞
l 冰冷却的 PBS (参见附录 A)
l 标记培养基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640 培养基，水浴预热到 37 ℃
l [35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸(800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 ×1013 Bq/mmol)
l 15或 50 ml 锥形聚丙烯离心管
l 对标记培养基充分透析的胎牛血清（FCS）
l L-谷氨酸.
l 微量吸管
l 恒温箱
l 离心机 (冷冻)
操作步骤
（一） 细胞的准备工作
1. 在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟，收集到 107-108 个细胞；
2. 在锥形离心管中，用10ml 37 ℃的标记培养基洗涤细胞，然后300 × g 离心5 分钟；
3. 丢弃上层清液；
4. 细胞沈淀加入标记培养基，重复洗涤一次。
（二） 前脉冲Prepulse
1. 洗涤后的细胞, 用37 ℃预热的标记培养基重新悬浮 (4 ml含 20 ×106个细胞) ，在37 ℃孵育 30分钟，间歇漩涡振荡，以耗尽细胞内原有的蛋氨酸和半胱氨酸；
2. 室温解冻[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸；
3. 注意: [35S] 蛋氨酸容易挥发，请在专用的、装有活性炭过滤器的通风橱内，打开[35S] 蛋氨酸储存液。目前，不易挥发的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸均有商品出售。
4. 细胞液在室温下, 以300 × g 离心5 分钟，弃上清。
（三） 脉冲Pulse
1. 将细胞团重新悬浮于标记培养基中 (浓度20 ×106个细胞/1 ml) ；
2. 加入 250 µCi 的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸 (9.25 ×109 Bq)；
3. 细胞放入37 ℃恒温箱中，孵育30 分钟到 3 小时，孵育期间经常振荡，以保持细胞悬浮；
4. 细胞液在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟，弃上清；
5. 警告: 使用过的培养基和洗涤液均含有放射性，因此，请按规定方法操作和处理放射性物质；
6. 用10ml 冰冷的 PBS 重新悬浮细胞，反复洗涤两次；
7. 按“细胞提取液的制备”（见Protocol 43）中的方法进行细胞处理和分析，或者-20 ℃冻存细胞。
质量要点
1. 如果脉冲需要持续1小时以上，需要在无菌的条件下，向标记培养基中添加2% 的胎牛血清和2%的 L-谷氨酸；
2. 对于大多数类型的细胞，可以采用带螺口的组织培养瓶，并在湿润的、含5% CO2的培养箱中进行孵育；
3. 孵育必须在37 ℃进行，温度低会显著地减少掺入到蛋白质中的放射性；
4. 也可以使用14C-标记的氨基酸作标记，其半衰期长，有利于在较长的时间（几个星期）内使用标记的蛋白质, 例如标记杂交瘤B细胞分泌的单克隆抗体，就常采用14C-标记的氨基酸混合物(丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸)。
参考文献
1. Coligan, J.E., Gates, F.T., III, Kimball, E.S. and Maloy, W.L. ( 1983) Radiochemical sequence analysis of biosynthetically labeled proteins. Meth. Enzymol. 91,413-434.
2. Meisenhelder, J. and Hunter, T. ( 1988 ) Radioactive protein labelling techniques. Nature (London) 335, 120.
（ 李京华 朱正美 ）
