【产品名称】
商品名称：甲型肝炎病毒(HAV)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name ：Hepatitis A Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】25T/盒、50T/盒
甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus, HAV）引起的一种肠道传染病。呈世界范围分布，我国为高发区，其发病为各型肝炎的首位。传统甲肝病毒的检测是通过细胞培养，由于HAV 细胞培养周期长，增殖能力低，一般不引起细胞病变，难以满足检测要求。PCR 技术提高了灵敏度和特异性，且大大缩短了检测时间，为甲肝检测带来便利[1-3]。
本试剂盒适用于检测的疑似感染者的血液等标本中甲型肝炎病毒 RNA，适用于甲型肝炎病毒感染的辅助诊
断。
本试剂盒用一对甲型肝炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对甲型肝炎病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
名 称 | 25T | 50T |
HAV 反应液 | 500μL×1 管 | 500μL×2 管 |
酶液 | 25μL×1 管 | 50μL×1 管 |
HAV 阳性质控品 | 50μL ×1 管 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 | 250μL ×1 管 |
注：
1） 不同批号试剂不能混用。
2） 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
疑似感染者的静脉血 2mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
按 RNA 提取试剂盒说明书进行提取。
推荐采用我司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照试剂说明书进行操作。
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满
7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 | HAV 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：
检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 请选择 NONE。
4.3 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 42℃ | 20min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
3 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 结果分析条件设定
设置Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
1. 所有操作严格按照说明书进行；
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3. 反应液应避光保存；
4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
[1] 张磊, 鲁淑婷, 李玉龙, 等. 甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒双重荧光定量 PCR 方法的建立及应用[J]. 中国实验诊断学, 2015.
[2] 邱丰, 郭敏卓, 伊瑶, 等. 甲型肝炎病毒实时荧光定量 PCR 检测方法的比较[J]. 医学研究杂志, 2013. [3]李淑焱, 刘大维, 田旺, 等. RT-PCR 一步法检测甲型肝炎活病毒方法的建立[J]. 微生物学杂志, 2005.
